发光细菌作为毒性检测的生物学方法，因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋发光细菌菌种；二为淡水发光菌法，采用的是淡水型发光菌种。
明亮发光杆菌T3法（A)
本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下，可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
1．原理
基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05)，因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性水平。
水质急性毒性水平可按选用相当的参比物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC50值（半数有效浓度，以样品液百分浓度为单位）来表征。
2．样品的采集与保存
①采样瓶使用聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。
②毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在2-5℃下保存样品，但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。
③对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。
3．仪器设备
①生物发光光度计：配置2ml或5ml测试管。
当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过±10%。
②2ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造），分别适用于相应型号的生物发光光度计。
③微量注射器：10μl。
④注射器：lml。
⑤定量加液瓶：5ml。
⑥吸管：2ml、10m1、25ml。
⑦试剂瓶：l00ml。
⑧量筒：100ml,500ml。
⑨棕色容量瓶：50ml、250ml、1000ml。
⑩半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：l0ml。
4．试剂和材料
除另有说明外，本方法所用试剂均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。
①氯化汞HgCl2。
②氯化钠NaCl，化学纯。
③明亮发光杆菌T3小种（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）冻干粉，安瓶瓶包装，每瓶0.5g，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细胞；当按5(3)④步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞（(5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）（均为稀释平板法测定）。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间，低于600mV允许将倍率调至“×2”档，高于1900mV允许将倍率调整至“×0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。
④氯化钠溶液，3g/100m1：氯化钠3g于玻璃容器内，用量筒加蒸馏水l00ml。
⑤氯化钠溶液，2g/l00ml氯化钠2g，加蒸馏水l00ml于试剂瓶内，2-5℃保存。
⑥参比物氯化汞标准溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
⑦氯化汞母液，ρ=2000mg/L:1/万分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g于50ml容量瓶中，用3g/100m1氯化钠溶液稀释至刻度，置2-5℃冰箱备用，保存期6个月。
⑧氯化汞工作液，ρ=2mg/L：用移液管吸氯化汞2000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中，用3g/l00ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml于250m1容量瓶中，用3g/l00m]氯化钠溶液定容。将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后用3g/l00ml氯化钠溶液将氯化汞2mg/L溶液按表5-3-6稀释成系列浓度（一律采用50ml容量瓶）。氯化汞工作液保存期不能超过24h，超过者务必重配。
5.试验程序
(1)稀释样品液
①样品液测定前稀释的条件：
样品液预试验：取事先加氯化钠至3g/l00ml浓度的样品母液2m1装入样品管，并设一支CK管（氯化钠3g/100m1溶液），按4②一③所述测定相对发光度。
若测得的样品，相对发光度低于50％乃至零，欲以EC50表达结果，则需稀释。
若测得的样品，相对发光度在1％以上，欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达结果，则不需稀释。
②样品液的稀释液：样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml的浓度添加氯化钠或浓溶液（母液只能加固体）。
③样品液稀释浓度的选择：
预试验：按对数系列将样品液稀释成五个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（其对数依次为0、-1、-2、-3、-4)，按5(2）和5(3）所述粗测一遍，视1％-100%相对发光度落在哪一浓度范围。
正式试验：在1%-100％相对发光度所落在的浓度范围内增配到6-9个浓度（例如，若落在0.1％-10％之间，则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1％-10％之间，则应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按5(2）-(3)所述再测一遍；这6-9个浓度，也可通过查对数表，按等对数间距原则自行确定（例如，若落在1％-10％之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，对数间距均为0.2)。
(2)测定条件
①室温：20-25℃。
同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃，且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的测试室内。
②pH：若需测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节待测样品pH。
若需测定排除pH影响在内的急性毒性，需在测定前将待测样品和CK（氯化钠3g/100m1）的pH调至下值：主要含Cu的水样为4.5，主要含其他金属的水样为5.4，主要含有机化合物的水样为7.0。
③溶解氧：本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。
(3)测定步骤
①试管的排列：于塑料或铁制试管架上按以下两种情况排列测试管。
a．按5(1)①所述，样品母液相对发光度为1％以上者，如下排列：
左侧放参比物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对照（CK）管，后二排放CK预试验管。每管氯化汞或样品液均配一管CK（氯化钠3g/100m1蒸馏水溶液）。设三次重复。每测一批样品，均需同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液。
b．按5(1)①所述，样品母液相对发光度为50％以下乃至零者，如下排列：
左侧仅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参比物浓度，其反应15min后的相对发光度应在50％左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同a。每测一批样品，均需同时配测氯化汞0.10mg/L溶液。
②加3g/l00ml氯化钠溶液：用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2m1或5ml氯化钠3g/l00ml（据仪器型号而定）。
③加样品液：用2ml或5ml吸管给每支样品管加2ml或5ml样品液（据5(3)②而定）。每个样品号换一支吸管。
④发光细菌冻干菌剂复苏
从冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块1-1.5L保温瓶，用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化钠2g/l00m1（适用于5ml测试管）或lml冷的2.5%氯化钠（适用于2m1测试管）注入已开口的冻干粉安瓿瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。
⑤仪器的预热和调零：打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。
⑧检验复苏发光细菌冻千粉质量：另取一空2m1或5ml测试管加2m1或5ml氯化钠3g/100ml（据5(3)②而定），加10μ1复发光菌液，盖上瓶塞，用手颠倒五次以达均匀。拔去瓶塞，将该管放入各自型号仪器测试舱内，若发光量立即显示（或经过5-l0min上升到）600mV以上，此瓶冻干粉可用于测试，低于者按4③处理。菌液发光量先缓慢上升，约持续5-15min，后缓慢下降，约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV，低于者更换冻干粉。
⑦给各测试管加复苏菌液：在发光菌液复苏稳定（约0.5h)后，按5(3)所述，从左到右，按氯化汞或样品管（前）-CK管（后）一氯化汞或样品管（前）-CK管（后）…顺序，用10μl微量注射器（勿用定量加液器以减少误差）准确吸取10μl复苏菌液，逐一加入各管，盖上瓶塞，用手颠倒五次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min，记作各管反应终止（即应该读发光量）的时间。
⑧发光细菌与样品反应达到终止时间的读数：按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，在不加瓶塞的情况下，立即将测试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示）。
⑨有色样品测定干扰的校正：
a．拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口；
b．取－2m1测试管（直径12mm)，加氯化钠3g/ml溶液2m1，将该管放进一装有少量氯化钠3g/100m1溶液的5ml管（直径20mm）内，要使外管与内管的氯化钠3g/l00ml液面平齐。此作CK管；
c．另取一2ml测试管，加氯化钠3g/ml溶液2ml，放入另一装有少量有色待测样品液的5ml管内，要使外管与内管的氯化钠3g/ml液面平齐。此作CKc管；
d．于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10μ1（注意：必须是本批样品测
定所用同一瓶复苏菌液），立即记时到秒，等反应满15min，迅速放入仪器测试舱，测定两支带有内管的5ml测试管的发光量。分别记下发光量Ll(CK管）和L2(CKc管）；
e．计算因颜色引起的发光量（mV）校正值ΔL=L1一L2；
f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常规步骤测试带色样品管及其CK管（氯化钠3g/l00ml溶液）的发光量（mV)。所有CK管测得之发光量（mV）均须减去校正值ΔL(mV）后才能作为CK发光量（mV)。
有色样品溶液测定干扰的校正示意图见图5-3-1。
6．质量保证与质量控制
①每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同，同批样品测定过程中应使用同一支发光菌，如果需做氯化汞标准曲线，也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用，可采用同批的两支混合后使用。
②国际上一般通用反应时间为5min或15min两种，鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性，采用15min。
③三次重复测定结果相对偏差确定为≤1％。
④测定应在采集样品后立即进行，在6h内不能测定应低温保存，但不得超过24h。
⑤关于样品如何稀释的问题，一般根据样品毒性大小决定，但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100％之外，可增配若干个浓度，使之落在1%-100％相对发光度范围内，以求相关方程。
⑥如果样品浓度为最高极限浓度（即100%）时，其相对发光率都不能使发光强度减少50%，则对样品的EC50值只能示为＞100%。
⑦鉴于发光细菌法实验因素的影响，实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时，应确定95％置信区间，即T=a+bC±2SE（SE为剩余标准差），以此求出的EC50也有一定的区间，可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性，就大多数而言，一般EC50值的变异系数在6％-10%。
北京百欧博伟生物技术有限公司的中国微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
明亮发光杆菌T3法（A)——发光细菌的急性毒性试验！
网址:http://zhoumo18701098095.fannawang.com/news/itemid-24682.shtml