一、实验材料
SD大鼠，细胞培养板，培养皿，小牛血清等
二、实验步骤之固定
⒈组织取材 SD 大鼠乙醚吸入麻醉后腹腔内注射氯胺酮(22 mg/kg)。 以左侧第 4 肋水平作横切口, 取胸大肌约 1 cm3 , 并将其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒 。反复用Hanks 液洗去血细胞 , 将肌小粒小心贴附于事先用明胶包被的细胞培养瓶底部 , 加入适量成肌细胞增殖培养液(Ham' s F-10 培养基中加入15 %小牛血清、青霉素100 U/ml 、链霉素 100 U/ml)。将瓶底向上轻置于37℃、5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中, 4 h 后轻轻翻转培养瓶 , 使肌小粒浸浴于培养液中。 3 d 换液一次 , 待细胞长满瓶底即可传代。
⒉成肌细胞的培养 采用组织块培养法贴块 2 d 后即可见有细胞从肌小粒边缘爬出 , 细胞呈梭形, 胞浆透明。1 周后细胞可长满瓶底的 60 %～ 70 %, 其数目可达 105 , 此时细胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分细胞密集区可见细胞呈向心性生长 , 相互间排列整齐 , 类似骨骼肌的纵切面。
⒊成肌细胞的分化鉴定 将传代后的细胞接种至 6 孔板, 加入增殖培养液 , 待细胞长至80 %满时, 换入成肌细胞诱导分化液(低糖DMEM培养基中加入 2 %马血清、0 .5%鸡胚提取物、青霉0100 U/ml 、链霉素 100 U/ml), 换用诱导分化液后细胞可在 3 d 内分化 , 融合交织形成肌纤维, 可观察到收缩现象;并且部分细胞分化形成细长的肌管, 高倍镜下可见多个核及核分裂象。这些现象为成肌细胞所特有, 可以作为简便的鉴定方法。
⒋成肌细胞的免疫荧光鉴定
免疫荧光在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5%Triton X-100( PBS配
制 )室温通透20min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（Desmin结蛋白）并放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
三、注意事项
（1）原代培养材料的选择，尽量选取完整的组织。
（2）要注意无菌操作。小心操作，避免污染细菌。其操作要求应高于外科手术。
（3）整个取材操作要迅速，不能过长，以细胞活性。
（4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。
所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。
（5）使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，不要使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。
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大鼠骨骼肌细胞原代分离培养实验方法！
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